Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è uno strumento importante per l’identificazione tassonomica dei batteri. I recenti sviluppi tecnologici hanno portato al suo miglioramento e alla sua disponibilità. Nonostante gli innegabili vantaggi di questo approccio, presenta diversi limiti e carenze.
Il solito risultato del sequenziamento del microbiota è una relativa abbondanza di taxa batterici. Mancano le informazioni sulla vitalità o l’enumerazione dei batteri. Tuttavia, questa conoscenza è cruciale per molte applicazioni.
Nel presente studio, è stato elaborato il flusso di lavoro completo per la quantificazione assoluta dei batteri viventi basata sul sequenziamento dell’amplicone, ovvero un frammento, del gene rRNA 16S.
Un reagente PMAxx fluorescente che penetra nella membrana cellulare danneggiata è stato utilizzato per discriminare tra la popolazione batterica totale e quella vitale. L’enumerazione dei batteri è stata stimata mediante la tecnica spike-in o la quantificazione qPCR.
Per l’ottimizzazione del metodo sono state prelevate venti specie batteriche e i risultati del flusso di lavoro sono stati convalidati da metodologie ampiamente accettate: citometria a flusso, placcatura microbiologica e vitalità-qPCR. Nonostante la piccola discrepanza tra tutti i metodi utilizzati, tutti hanno mostrato risultati compatibili.
Infine, è stato testato il flusso di lavoro con campioni di alimenti reali con una buona correlazione tra i metodi per quanto riguarda la stima del numero di batteri vitali.
DOI: 10.1016/j.crfs.2023.100443
Quantificazione assoluta dell’abbondanza di batteri vitali negli alimenti mediante sequenziamento di nuova generazione: NGS quantitativo di microbi vitali
Absolute quantification of viable bacteria abundances in food by next-generation sequencing: Quantitative NGS of viable microbes. Current Research in Food Science, Volume 6, 2023
A. Kallastu, E. Malv, V. Aro, A. Meikas, M. Vendelin, A. Kattel, R. Nahku, J. Kazantseva
